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可分離式甲苯磺酰基磁珠

BcMag^TM可分離式甲苯磺酰基活化磁珠是表面覆蓋有高密度甲苯磺酰基官能團的二氧化硅基質(zhì)的磁珠。甲苯磺酰基活化磁珠可以在不引入任何電荷的情況下，在水或有機溶劑（30%DMF）中有效地共價結(jié)合含有伯胺基的配體。因為活性醛基基團通過內(nèi)置的可切割二硫鍵連接物（圖1）與磁珠連接，因此，可用還原劑（如DTT或β-巰基乙醇）從磁珠上切割并分離出目標(biāo)分子-配體的復(fù)合物。可分離式甲苯磺酰基磁珠是結(jié)合大分子蛋白和多肽的理想選擇。

甲苯磺酰基活化磁珠是將抗體，多肽，完整蛋白質(zhì)和功能酶共價連接到磁珠表面的理想選擇。固定化的磁珠由于其低背景和抗體與磁珠表面的共價結(jié)合，而廣泛用于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的免疫沉淀。

甲苯磺酰基活化磁珠偶聯(lián)反應(yīng)在37℃下進行，pH范圍在偏堿性環(huán)境。我們建議在pH 8.5-9.5下偶聯(lián)，但與高pH不穩(wěn)定配體的偶聯(lián)可以在pH 7.4的替代緩沖液中進行。

產(chǎn)品獨特的干燥狀態(tài)避免了丙酮溶劑儲存的麻煩，或液體去除和處理的需要。此外，由于干基質(zhì)在膨脹時濃縮樣品，減少了起始材料的體積，并且會提高配體固定化的效率，因此它非常適合與濃度較低樣品進行偶聯(lián)反應(yīng)。

工作流程

本磁珠作為固體載體可以完美地用于各種親和純化，將分子，細胞和部分細胞進行純化。只需要與配體結(jié)合后，將磁珠添加到含有目標(biāo)分子的溶液中，然后混合，孵育，清洗和洗脫目標(biāo)分子（圖2）

特點和優(yōu)勢：

l 預(yù)活化，即用型磁珠

l 含有一個可切割的內(nèi)置二硫鍵，可將配體-目標(biāo)分子復(fù)合物從磁珠中分離出來。

l 便于使用

l 結(jié)和后表面不會帶電荷

l 穩(wěn)定的共價鍵，低水平的配體泄漏 

l 可重復(fù)使用的免疫親和基質(zhì)           

l 極低的非特異性結(jié)合率 

l 可固定1-10mg蛋白或0.1-1mg多肽/ml的磁珠 

l 用途：用于純化抗體，蛋白質(zhì)/肽，DNA / RNA;細胞篩選、免疫沉淀

操作過程

提示：

l 強烈建議在實驗過程中進行滴定優(yōu)化，以確定每個實驗中應(yīng)用的磁珠數(shù)量。該協(xié)議可以相應(yīng)地放大和縮小。

l 避免使用含有還原劑、tris或其他含有伯胺或其他親核類試劑的緩沖液，因為它們會破壞二硫鍵連接物或與預(yù)期的偶聯(lián)反應(yīng)競爭。但wash buffers和 storage buffers 可含有氨基或羧基成分。

所需耗材

1.磁力分離器（適用于手動操作）：根據(jù)實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號的磁力分離器：

BcMag? separator-2可以容納兩個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);

BcMag? separator-6可以容納六個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);

BcMag? separator-24可以容納24個單獨的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);

BcMag? separator-50可以容納一個單獨的50 ml離心管，一個15ml的離心管，以及四個1.5ml離心管(Cat.# MS-04);

BcMag? separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).

2.Coupling Buffer: 0.1 M磷酸鈉緩沖液，pH 7.4

提示：

l coupling buffers應(yīng)具有最小的離子強度，且不應(yīng)含有任何具有氨基（如Tris）的成分。但wash buffers 或者storage buffers可含有氨基或羧基。

l 水不溶性配體可以在含有30%有機溶劑（30%DMF）的coupling buffers中結(jié)合。

3. Blocking Buffer: PBS pH 7.4 含有 0.5% (w/v) BSA

4. Washing buffer: PBS pH 7.4含有 0.1% (w/v) BSA

A.磁珠的準(zhǔn)備

1.用100%異丙醇制備3%的磁珠（30 mg/ml），并充分混合。

提示：將未使用的磁珠可以在異丙醇溶液中，儲存在4℃。可保存一年時間。

2.將100μl（3mg）的磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中。

3. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時，去除上清液。從磁力分離器上取下試管，加入1ml的coupling buffer用通過渦旋30秒重新懸浮磁珠。

4.重復(fù)步驟3 兩次。

5.去除上清液，將清洗的磁珠準(zhǔn)備進行耦合反應(yīng)。

注：使用coupling buffer重新水化后，由于官能團的穩(wěn)定性，應(yīng)盡快使用磁珠。

B.蛋白質(zhì)結(jié)合

1.用coupling buffer制備100μl蛋白質(zhì)溶液（0.5-1mg/ml）或多肽溶液（200μmol/ml）。

提示：偶合效率因配體而異。用戶可應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗優(yōu)化配體的濃度。

2. 將蛋白質(zhì)或者多肽溶液與上述清洗過的磁珠混合，通過渦旋或者吹吸的方式。

3. 孵育反應(yīng)，在20-25℃溫度下偶合至少需要24-48小時。在4℃下耦合時，培養(yǎng)時間

應(yīng)至少延長至48-72小時。

4. 用1ml的washing buffer將磁珠洗滌3次。

5. 向磁珠中添加1ml的blocking buffer，并在室溫下孵育1小時或4℃過夜。

6. 用1 ml的PBS洗滌磁珠4-6次。

7. 用含有0.1%疊氮化物（w/v）的PBS緩沖液重新懸浮磁珠至所需濃度，在

4°C下儲存，直至使用。不要冷凍保存。

C．常見親和純化過程

提示：

l 該方案是一個通用的親和純化發(fā)法。因為沒有兩種蛋白質(zhì)是完全相同的，所以不可能為所有的蛋白質(zhì)純化設(shè)計一個通用的協(xié)議。為了獲得最佳結(jié)果，每個用戶必須確定純化單個目標(biāo)蛋白的最佳工作條件。

l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用還原劑。

l 強烈建議根據(jù)粗樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量，進行滴定，以優(yōu)化每個單獨實驗   

中使用的磁珠數(shù)量。使用過多的磁珠將導(dǎo)致較高的背景，而使用過少的磁珠將導(dǎo)致較低的產(chǎn)量。每毫克磁珠通常可與1-20μg靶蛋白結(jié)合。

1.將適量的珠子轉(zhuǎn)移到離心管中。將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全沉淀時，去除上清液。

2. 取下試管，加入5倍磁珠溶液體積的PBS緩沖液，通過震蕩重新懸浮磁珠，渦旋30

秒。將試管至于室溫環(huán)境1-3分鐘，再將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當(dāng)磁珠完全

沉淀時，去除上清液。

3.重復(fù)步驟2 兩次。

4. 向含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的粗樣品中添加洗滌過的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴1-2小

時（溫度越低，培養(yǎng)時間越長）。

提示：強烈建議進行滴定實驗以優(yōu)化培養(yǎng)時間。因為孵化的時間太長可能會導(dǎo)致很高的背景。

5. 用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl徹底清洗磁珠，直到280nm處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。

    提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也可能會降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加NaCl（濃度為1-1.5 M）、0.1-0.5%的非離子洗滌劑，如Triton X-100或Tween-20，以及還原劑，如DTT或TCEP（我們通常使用3mM）。

6. 通過適當(dāng)?shù)姆椒ǎ绲?/span>pH（2-4）、高pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸，洗脫目標(biāo)蛋白。

7.切斷二硫鍵

提升：由于配體之間的構(gòu)象不同，用戶應(yīng)確定最佳工作條件，如還原劑、pH值和溫度，以切割單個配體的二硫鍵。以下是從磁珠上切割共軛的GFP蛋白的示例。

1）在140 mMβ-巰基乙醇或5 mM DTT（二硫蘇糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。

a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巰基乙醇條件下，室溫2小時或

者過夜孵育，或者在98℃條件下5分鐘。

b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT條件下，室溫2小時或者過夜孵

育，或者在98℃條件下5分鐘。